BIOANALITICKE METODE
*
Hemijske metode
*
Hromatografske metode
*
Masena spektrofotometrija
*
Metode sa izotopima
*
Spektrometrijske, fluorimetrijske, polarografske metode
*
Kapilarna elektroforeza (CE)
*
*
U opstem smislu, elektroforeza je metoda razdvajanja naelektrisanih supstanci prema brzinama kretanja u elektricnom polju.
*
Krajem 20-ih godina XX veka
*
Arne Tiselius 1930.god je doktorirao sa tezom “TEHNIKA POKRETNIH GRANICA U PROUCAVANJU ELEKTROFOREZE PROTEINA”.
*
1936.god Tiselius se vraca razvijanju tehnike elektroforetskih razdvajanja I ispitivanjima mogucnosti upotrebe fizickih metoda za resavanje problema u biohemiji.
*
1937.god objavio je rad na temu razdvajanja serumskih proteina znatno usavrsenom tehnikom elektroforeze.
*
Sa saradnicima je nastavio rad na elektroforetskim razdvajanjima I odredjivanjima , za sta je
*
1948. god dobio Nobelovu nagradu za hemiju
KAPILARNA ELEKTROFOREZA (CE)
*
Izvodi se u kapilarama (najcesce fused silica) ciji je unutrasnji precnik najcesce 25-75 μm (mogu biti u opsegu od 5-100μm)
*
U elektricnom polju cija jacina moze ici I do 700V/cm uz odgovarajuci pufer I nacin detekcije
Vreme migracije jedinjenja koje se ispituje, analita (t) je:
*
t= L2/μU
*
Gde je t vreme migracije analita,
*
L-duzina kapilare
*
μ-elektroforetska pokretljivost analita
*
U-napon
*
Iz ove jednacine se vidi da je vreme zadrzavanja tj migracije analita utoliko krace ukoliko se primenjuje visi napon u sto kracoj kapilari.
Ogranicenja
*
-Zagrevanjem medijuma usled protoka struje
*
-Jacina primenjenog elektricnog polja odredjuje efikasnost razdvajanja, ali I promenu temperature medijuma (pa se u klasicnoj elektroforezi ne mogu koristiti elektricna polja jaca od 100V/cm)
*
-Elektrooosmoza
*
-Disperzija (sirenje) zona razdvajanja
*
-Svi ovi faktori direktno zavise od osobina uzorka (Mr, pKa, strukture, obrazovanja kompleksa) I instrumenta kojim se odredjivanje izvodi ( duzina kapilare, jacina primenjenog el. polja)
*
Idejom da se elektroforeza izvodi u kapilarnim kolonama I konstrukcijom prvog komercijalnog aparata za “mikro” elektroforezu 80-ih godina XX veka kapilarna elektroforeza postaje jedna od vodecih metoda na polju analitickih razdvajanja I odredjivanja.
Prednosti kapilarne elektroforeze
*
Efikasnost
*
Brzina I jednostavnost u podesavanju selektivnosti
*
Ova tehnika pokazuje dobro razdvajanje analiziranih jedinjenja sa mogucnoscu razdvajanja I enantiomera.
*
Moc razdvajanja je mnogo veca I od HPLCa
Primena kapilarne elektroforeze:
*
CE se koristi za razdvajanje I odredjivanje velikog broja bioloskih molekula kao sto su aminokiseline, peptidi, proteini, fragmenti DNK, nukleinske kiseline kao I pojedinih malih molekula kao sto su lekovi ili cak metalni joni.
*
Primeri lekova koji se mogu odrediti na ovaj nacin su morfin, kodein, heroin, amfetamin, kofein, naproksen, izoproterenol.