Seminarski-imunohemijske metode

[Harry]

Uvedene pre skoro 50 godina , mnogo su usavrsavane I danas se mogu nabaviti gotovi testovi za veliki broj lekova.
IMUNOHEMIJSKE METODE
(principi imunotestova)

Imunotestovi su metode u kojima se kao reagensi koriste At za kvantitativno odredjivanje Ag u uzorcima.

U nekim sluèajevima, kvantitativno se mogu odredjivati i At u uzorcima, pri poznatim koncentracijama Ag.

U svim imunotestovima osnovni cilj metodologije je detekcija kompleksa Ag-At, pa je metoda koja se koristi za detekciju obièno i naziv datog imunotesta ako se kao obele¾ivaè koristi:
Radio izotop->radio imunotest (RIA)
Enzim -> Enzimimunotest (EIA):
1. EMIT
2. ELISA
Fluorohrom- fluorescentni imunotest

Osim metode za detekciju imunotestovi se, po principu kvantitativnog odredjivanja, dele na:
1. kompetitivne
Antigen iz test uzorka konkurise zajedno sa nepromenljivom (standardnom) kolicinom obelezenog Ag za odredjenu standardnu kolicinu antitela.
2. Nekompetitivne
Antigen iz ispitivanog uzorka se vezuje za At koja su u visku imobilisana na plasticnoj povrsini ili matriksu. Vezani Ag se detektuje pomocu obelezenog sekundarnog At koje prepoznaje razlicite epitope datog Ag u odnosu na primarno imobilisano At.
-Koncentracija Ag je proporcionalna signalu koji se detektuje sa sekundarnog antitela pa je za odredjivanje malih koncentracija Ag pogodniji I osetljiviji nekompetitivni imuno test od odgovarajuce kompetitivne metode.
Kod svih ovih metoda najcesce se pri merenju koriste tehnika zasicenja pri kojoj se Ag I obelezeni Ag*  (radioizotopom, enzimom ili fluorescirajucom grupom) takmice za aktivna mesta na At.
Pri stalnoj kolicini At I obelezenog Ag* kolicina vezanog, obelezenog Ag* zavisi od koncentracije neobelezenog Ag u rastvoru (leka u uzorku)
Ag*+ At -> Ag*At + Ag (uzorak)
Dolazi do istiskivanja:
Ag+ Ag*At-> AgAt+Ag*
Kod ovih metoda potrebno je imati antitela sposobna da vezuju lek koji se ispituje. Vecina lekova ima malu Mr (manju od 1000) , oni obicno nisu antigeni, tj ponovljeno davanje lekova eksperimentalnim zivotinjama ne izaziva stvaranje antitela.
Da se dobiju antitela koja ce vezati lek, potrebno je da se lek konjuguje kovalentno (kao hapten) sa antigenim proteinom pre imunizacije. U sintezi lek-protein konjugata najcesce se koriste serumski albumini razlicitih vrsta. Nakon stimulacije ovako dobijenim lek-protein konjugatom dolazi do stvaranja antitela specificnih za hemijski vezan lek.
Veoma vazna osobina imunog odgovora na kojoj se ove metode zasnivaju je prepoznavanje samo malih delova antigenog molekula od strane antitela stvorenih u odgovoru na stimulaciju



Radioimunotestovi

ovi testovi su najranije razvijeni ali uprkos jednostavnosti izvodjenja i velike osetljivosti, ovi imunotestovi imaju praktiène nedostatke.

Prvo, zahtevaju relativno skupu opremu (brojaèi radioaktivnosti), neki radioizotopi imaju kratko vreme poluraspada (¹to uzrokuje ogranièeno vreme kori¹æenja imunodijagnostièkog komercijalnog kompleta), treæe, rad sa radioaktivnim materijalom je potencijalno ¹tetan po zdravlje, i èetvrto, poseban problem je skladi¹tenje i odlaganje radioaktivnog otpada.

upotreba radioizotopa nije ogranièena samo na kvantitativne tehnike jer se i u elektroforetskim analizama (elektroforeza, Western blot) koriste At obele¾ena izotopima (autoradiografija).


Klasièna RIA (RIA u teènoj fazi, kompetitivna RIA)

za obele¾avanje Ag uglavnom se koriste sledeæi izotopi: J125, J131, H3, C14.
polipeptidni hormoni se obièno obele¾avaju J125 i J131 jer u svojoj molekuli sadr¾e tirozinske ostatke dok se steroidne supstance obele¾avaju pomoæu H3 ili C14.
U RIA, Ag iz ispitivanog uzorka konkuri¹e radioaktivno obele¾enom Ag (Ag*) u vezivanju za isto At.
posle separacije slobodnog obele¾enog Ag*, meri se kolièina radioaktivnosti kompleksa Ag-At* ili slob. Ag* i pomoæu standardne krive odredjuje kolièina Ag u uzorku.
J125-gama emiter; merenje se vr¹i u gama scintilacionim brojaèima, dok se kod beta emitera (H3) koristi teèni scintilacioni brojaè.
ako se meri aktivnost slob. Ag* dobijene vrednosti su u funkciji kolièine ispitivane supstance, dok su vrednosti dobijene merenjem vezane obele¾ene supstance obrnuto proporcionalne kolièini ispitivane supstance.
Primena: koristi se za detekciju izuzetno malih kolièina Ag (proteinski hormoni, Ag virusa hepatitisa B, steroidi, prostaglandini,
pojedini citokini).




2) Enzimski imunotestovi (EnzymeImmunoAssay-EIA)
Ovde su Ag, hapten ili At obelezeni enzimom cije se delovanje na supstrat moze meriti a meri se apsorbancija u UV ili VIS oblasti.
Pomocu ovih metoda identifikuju se I/ili odredjuju Ag ili At u bioloskim tecnostima
EIA moze da se koristi kao kvalitativni, semikvantitativni ili kvantitativni test.
danas praktièno svi kvalitativni i kvantitativni radioimunolo¹ki testovi imaju svoju zamenu u enzimskim tehnikama.
osnovna prednost je u stabilnosti reagensa, opremi za izvodjenje, mo¾e se istovremeno izvoditi veliki broj testova, metoda se mo¾e automatizovati itd.


     ELISA(enzyme linked immuno sorbent assay)

Enzim treba da je bezbedan, jeftin i da generi¹e odgovarajuæu kolièinu stabilne boje.
Alkalna fosfataza se mo¾e smatrati enzimom izbora u ELISI jer je konjugovan za proteine stabilan.
- izvor ovog enzima su tanko crevo teleta i E. coli, pa je samim tim dosta skuplji od peroksidaze.
- supstrat koji se koristi kod spektrofotometrijskog merenja je p-nitro-fenil-fosfat (PNP) koji je stabilan, bezbedan i dostupan u tabletama.
ELISA test je heterogen, zahteva odvajanje nevezanog Ag od Ag-At kompleksa.
Kao u vecini imunotestova, separacija Ag-At kompleksa od slobodnog Ag I At predstavlja veoma znacajan korak u izvodjenju testa jer se nevezani obelezen Ag ili At moraju prethodno ukloniti kako bi se izmerila kolicina Ag-At  kompleksa. Jedan od najcesce primenjivanih postupaka za odvajanje slobodnog od vezanog Ag je precipitacija pomocu sekundarnog At, a drugi imobilizacija At na plasticnu povrsinu, matriks ili papir I membrane
-jednostavno to je ispiranje nevezanog Ag
ELISA:


EMIT(Enzyme Multiplied     Immunoassay Tecnique)

-homogeno enzimsko imunoodredjivanje (moze se odrediti Ag-At kompleks bez prethodne separacije nevezanog Ag ili At). Time se stedi vreme , smanjuje cena analize pa homogeni testovi imaju prednost u odnosu na heterogene.
Osnovni princip EMIT odredjivanja je da se aktivnost enzima (obelezivaca) u kompleksu At-Ag-Enzim ili inhibira ili stimulise u poredjenju sa aktivnoscu u slobodnom Ag-enzim konjugatu.
Upravo ovo cini fazu separacije
EMIT se primenjuje za odredjivanje malih molekula npr lekova kao sto su barbiturati, opijati, digoksin, fenotoin, fenobarbiton, teofilin I tiroksin. Ovom tehnikom NE MOGU da se odredjuju veliki molekuli jer pri vezivanju trenutno inaktiviraju enzim.


Postupak izvodjenja EMIT testa:
Uzorak koji sadrzi Ag mesa se sa odredjenom kolicinom At I konjugata Ag-Enzim. At se kombinuju sa Ag ili haptenom iz uzorka ili sa Ag ( haptenom) koji je oznacen enzimom. Kataliticka aktivnost izmerenog enzima u ovoj smesi je direktno ili indirektno proporcionalna kolicini Ag u uzorku. U ovoj reakciji At smanjuju afinitetet supstrata za aktivno mesto enzima , sternim ometanjem ili konformacionom promenom strukture enzima ili umanjivanjem konformacionih promena potrebnih za kataliticku aktivnost enzima.

Prednosti imunohemijske metode:
Osetljivost ovih metoda omogucava odredjivanje raznih lekova koji na drugi nacin ne mogu adekvatno da se odrede kao sto su npr kardiotonicni glikozidi (heterozidi), opijati I slicno.
Jednostavnost I brzina omogucuju njihovu rutinsku primenu. To omogucuje obradu velikog broja uzoraka I koriscenje malih kolicina materijala pa su veoma pogodne za odredjena farmakineticka ispitivanja.

Nedostaci:
Nisu potpuno selektivne (nedovoljna specificnost antitela tako da metaboliti i/ili slicni lekovi mogu lako da ometaju ispitivanje a ispitivanje mogu da ometaju I neke supstance iz podloge.
Razlicite serije At mogu veoma mnogo da se razlikuju u aktivnosti I osetljivosti I time onemogucavaju reproduktivnost.

Selektivnost, osetljivost I reproduktivnost imunohenijskih metoda danas se povecava upotrebom monoklonskih At koji se proizvode kontinuiranom sekrecijom od strane imortalizovanih celija hibridizovanih sa ljudskim proteinima imaju pojedinacnu selektivnu specificnost I otuda mogu da imaju znacajne primene u farmakoterapiji .Posebno su znacajni za biotehnoloske kompanije.