Bredove beleske iz imunologije

[Bred]

Evo nekih mojih beleski za prakticni......

Precipitacija

Predstavlja reakciju izme|u solubilnog antigena i specifi~nog antitela.
Uspeh metode zavisi od broja molekula Ag i broja molekula At, precipitat se formira kada je broj Ag i At u ekvivalentnom odnosu 1:1. Kada je Ag ili At u vi{ku precipitata nema.

Pri radu se uzima serija epruveta, stavi se ista koli~ina At i dodajemo u svaku epruvetu razli~itu koncentraciju Ag (mo`e i obrnuto).

Fenomen prozone – pojava negativnih rezultata (nema precipitata), dakle u vi{ku su ili Ag ili At.


Metode precipitacije:

§ u te~nom medjiumu
§u polu~vrstom medijumu (gel)


I Ring test (interfacijalni test proteina) – kvalitativna metoda, u te~nom medijumu. U epruvetu se sipa izdvojeno At za koje se zna da vezuje neki Ag. Sipamo serum – biolo{ki uzorak, u kome se pretpostavlja da postoji odgovaraju}i At. Dodajemo polako uz zid epruvete poznat Ag.

Dolazi do difuzije, pasivan process zavisi od koncentracionog gradijenta. At idu gore, Ag idu ka dole (u na{em slu~aju, mo`e i obrnut slu~aj). Na mestu susreta stvara se prsten – precipitat, i time je potvr|eno prisustvo antigena. Mada ako je negativan rezultat, moramo uzeti u obzir i koncentracije Ag i At, jer se mo`e desiti da je rezultat negativan jer nije postignuta ekvivalentna koli~ina Ag i At.

Stoga se uzima nekoliko epruveta koje sadr`e istu koncentraciju antitela, a mi dodajemo razli~ite koncentracije Ag, da bi na{li opseg ekv. Koncentracija.
Ova reakcija se koristi za proveru Ag antraksa – Askalijeva metoda.

Nefelometrija – kvantitativna metoda, odre|uje se konc. nekog Ag, zasniva se na fizi~kom fenomenu da te~nost rezli~ite bistrine (mutno}e) rezli~ito prelamaju svetlost.
Mere se Ag u biolo{kim te~nostima, i mali solubilni kompleksi menjaju bistrinu rastvora i dolazi do promene prelamanja svetlosti. Uzorak je pro~i{}eno At, dospemo biolo{ki uzorak, merimo konc. Ag, svetlost se prelama pod odre|enim uglom. Ugao je proporcionalan koncentraciji antigena. Moraju se koristiti standardi. Uzima se ista konc. At i razli~ite koncentracije Ag. Pravimo grafik gde nanosimo ugao skretanja i koncentraciju Ag. Dobija se kriva, a na osnovu ugla odre|ujemo koncentraciju Ag. Koncentracija At je konstantna.
Koristi se za merenje imunoglobulina G,M,A ; D i E se ne mogu meriti ovom metodom.
Na ispitu mo`e biti pitanje – u epruveti se nalazi specifi~no C3 antitelo

II Metode u polu~vrstom medijumu – gel

Radijalno imunodifuzija RID – metoda u gelu, u tom gelu je ravnomerno raspore|eno odre|eno At, ~ija je koncentracija ista u svakom delu gela. U gelu se bu{e rupe – bazeni, u te rupe se nanose uzorci, oni difunduju.Ako u uzorku postoji Ag koji se vezuje za At u gelu, formira}e se prsten oko bazena – precipitaciona linija, gde je pre~nik linije proporcijalan koncentraciji Ag. Ovo je kvantitativna metoda.
Unosimo prvo nekoliko standarda – poznate konc. Ag i nepoznatu koncentraciju. Formira}e se precipitacione linije.

Konstrui{emo grafik na osnovu pre~nika standarda (podignutih na kvadrat da bi se dobila bolja rezolucija) i poznatih koncentracija.Kada se konstrui{e kriva nanosi se i pre~nik uzorka nepoznate koncentracije.


Difuzija je jako spor process, trebalo bi 2-3 dana da se obavi ova metoda tako da je sporost mana ove metode.


Dvostruka imunodifuzija – kvantitativna i semikvantitativna metoda u gelu.I Ag i At difunduju. Gel je prazan, izbu{imo dva naspramna bazena i u jedan stavimo Ag, a u drugi At. Ako je precipitaciona linija bli`a Ag zna~i da je At u vi{ku, pa je metoda semikvantitativna.

Zonska elektroforeza – u gelu, na odre|enoj pH ve}ina proteina se kre}u ka anodi (+) jer su na toj pH negativno naelektrisani. U zavisnosti od koli~ine, konformacije, veli~ine proteini se razli~ito kre}u kad je pu{tena struja. Sipamo uzorak, pustimo struju, bojimo bojama. Dobijamo 5 traka: albuminska, α 1, α 2, b , γ. Imunoglobulini su u γ globulinskoj traci, kod seruma zdravih osoba. Ukoliko su trake pomerene, imamo neki poreme}aj. Ako je poja~ana γ – globulinska traka, ukazuje na vi{ak At, usled malignih poreme}aja.
Elektroforeza se koristi za identifikaciju:
§ hipogamaglobulinemije
§paraproteinemija (druga~iji proteini, defektni)

Imunoelektroforeza – plo~ica, uzorak, pu{tena struja, proteini su se razdvojili, paralelno sa strujnim kolom je kanal sa At. Proteini difunduju radijalno, u svim pravcima.At difunduju frontalno na gore. Formiraju se lukovikao linije precipitacije. Luk ima odre|en oblik i veli~inu. U kanal se stave At za sve Ag, dobijamo mnogo lukova; od rasporeda lukova zavisi da li je sve u redu.

Raketna elektroforeza – kvantitativna metoda, u gelu imamo ravnomerno raspore|eno antitelo, imamo bazene gde stavljamo Ag, plo`ica se stavlja u strujno polje. Na pH 8.6 proteini pri elektroforezi difunduju ka anodi. Kod ove metode se meri visina rakete (pika, koji ustvari predstavlja precipitacionu liniju) Pravi se kalibraciona kriva, za nepoznatu konc. imamo visinu rakete.
Mana metode je {to nisu svi proteini naelektrisani negativno. Imunoglobulini su naelektrisano pozitivno, pa ih ne mo`emo meriti ovom metodom. Prednost metode je brzina.

Protiv strujna elektroforeza – zasniva se na pojavi da ve}ina negativno naelektr. proteina, idu ka anodi, dok imunoglobulini idu ka katodi. Imunoglobuline stavljamo ka anodi jer idu ka katodi dok ostale stavljamo kod katode. Gde se susretnu stvara se precip. linija koja govori da li imamo Ag i At. Test se mo`e vr{iti tako {to uzimamo serum i delimo ga na dva dela; jedan deo stavljamo kod katode, a drugi kod anode.

Aglutinacija

Je reakcija izme|u Ag i At. Ag je korpuskularan, tj. Vezan za neku ~esticu ili }eliju.

Uslov da bi do{lo do aglutinacije je da se ostvari ekvivalentan odnos Ag i At.

Veli~ina partikula, elektrostati~ki naboj partikula, gustina antigenskih determinanti, polivalentna At, uti~u na aglutinaciju.

Kao primer pogodnih partikula su eritrociti koji su istog naboja i u suspenziji se me|usobno odbijaju.

Vi{e Ag determinanti na ~esticama ® ve}a aglutinacija

Antitela – aglutinini – antitela koja vr{e aglutinaciju, At IgM (10 vezivnih mesta – pentameri su) klase su bolji aglutinini od At IgG klase. Veliki su molekuli, dr`e se na odre|enom rastojanju od }elije, i one ne mogu da se odbijaju, naboj je slobodan.
At IgM klase nazivaju se kompletna – jer izazivaju aglutinaciju eritrocita. Nekompletna ili blokiraju}a ne mogu da izazovu aglutinaciju eritrocita jer zauzimaju vezna mesta na Ag (npr. G klasa – monomeri, imaju dva vezna mesta, mala su u odnosu na }elije na kojima se nalaze Ag i ne mogu da savladaju naboj). Kad je velika gustina Ag determinanti onda i nekompletna tela mogu dati aglutinaciju.

Pomo}u aglutinacije mo`emo da odredimo TITAR. Titar At je recipro~na vrednost najve}eg razbla`enja seruma koja daje jasno vidljivu aglutinaciju, to se odnosi na koli~inu antitela.

Odre|ivanje titra:

Razbla`ujemo serum i pravimo nekoliko razbla`enja. Jednu epruvetu koristimo kao negativnu kontrolu. U svaku epruvetu dodajemo istu koli~inu Ag ( eritrocita, ako se tra`e antieritrociti) i pratimo u kojim epruvetama je do{lo do aglutinacije. Aglutinacija se uo~ava kao difuzno zamu}enje iznad dna epruvete, dok tamo gde nema aglutinacije eritrociti padaju na dno i daju tzv. eritrocitno dugme.

U negativnoj kontroli se ne javlja aglutinacija, to je kontrola tehike.
U ovom slu~aju titar je 8 , 1:8 je najve}e razbla`enje pri kome se javlja aglutinacija, a 8 je recipro~na vrednost od 1/8. [to je ve}i titar to je ve}e razbla`enje, imamo vi{e At, imamo jak serum koji mnogo puta razbla`ujemo i opet daje aglutinaciju

§§§ kada na ispitu imamo pitanje Titar, pri~amo o razbla`enju i uvek se razbla`uje ono {to tra`imo, npr. ako su nepoznata At, razbla`ujemo ono gde se At nalaze.

Direktna aglutinacija – Ag je sastavni deo }elije, njen prirodni deo; njena primena je u mikrobiologiji za detekciju bakterijskih }elija koje imaju na povr{ini }elije antigena.
Gruberov i Vidalov test.

Paul – Bunnel-ov test (direktna aglutinacija)

Detektujemo infektivnu mononukleozu, izazva je Ep{tejn-Barov virus. U ovom testu odre|ujemo heterofilna At. Ova Atmogu da reaguju sa Ag koji je izazvao njihovo stvaranje i sa sli~nim Ag, to se zove ukr{tena reaktivnost.
U testu se koriste ov~iji eritrociti (kao nosioci Ag) zbog ukr{tenih reaktivnosti At stvorenih na virus. Normalno postoje ta At u malom titru, ali za dijagnostiku ove bolesti titar treba da je ve}i od 60.

Indirektna aglutinacija – u pitanju su solubilni Ag koji su adsorbovani na neke nosa~e, a nosa~ je }elija ili lateks ~estice. Naj~e{}e se kao nosa~i koriste ov~iji eritrociti jer su dostupni u velikom broju i hemoaglutinacija je lepo vidljiva.
Neki Ag se mogu pasivno adsorbovati, dok je za neke Ag potrebna prvo obrada eritrocita taninskom kiselinom ili gluter-aldehidom.Ovim postupkom dobija se ve}a gustina antigenskih determinanti.

Rose – Walerov test

slu`i za odre|ivanje reumatoidnih faktora (to su anti-IgG antitela G ili M klase).Njegov Ag je IgG At, to su antitela na antitela i stvaraju se kod nekih autoimunih bolesti – reumatoidni artritis. Autoimune bolesti se razvijaju kada na{ imuni sistem ne prepoznaje na{a At.

Epitopi se nalaze u konstantnom regionu At i oni bivaju prepoznati. G ili M klasa – konstantni deo odre|uje klasu (monomer ili pentamer)

Koristimo ov~ije eritrocite za koja su vezana ze~ija IgG antitela (zec je imunizovan i stvorio je svoja antitela na ov~ije eritrocite).Na{ serum se me{a sa tim i ako imamo anti-IgG javlja se aglutinacija. Ze~iji IgG i na{i su sli~ni.
Kada se koriste latex ~estice kao nosa~i IgG umesto ze~ijih koriste se humani IgG molekuli, a umesto ov~ijih eritrocita latex kuglice.

Obrnuta indirektna aglutinacija – iz praktikuma

Inhibicija hemaglutinacije

Princip testa za trudno}u

Datektuje se humani horionski gonadotropin, hormon koji se stvar u trudno}i (antigen HCG) , tra`i se u urinu. Potrebna su nam antitela HCG (anti-HCG-antitela), a u drugoj bo~ici su eritrociti sa HCG molekulima.
Prvi korak je me{anje At i uzorka, i posle toga se dodaju eritrociti.
Ako u urinu ima HCG, vezuju se za At. Eritrociti imaju isto {to je i u urinu, i kad dodajemo eritrocite nema aglutinacije, zna~i Ag HCG je zauzeo mesto eritrocitima sa HCG.
Ako u urinu nema HCG, onda se At u slede}em koraku vezuju za HCG na eritrocitima i dolazi do aglutinacije (hemaglutinacije)

KRVNE GRUPE

Danas je poznato 27 sistema krvnih grupa, a najpoznatija dva sistema su:

I ABO
II Rh factor

I Pripadnost nekoj krvnoj grupi odre|uje prisustvo anti-A ili anti-B-antitela u serumu.


Izohemaglutini (anti-A i anti-B antitela) su prirodna At, ali se u serumu stvaraju na intestinalne mikroorganizme u crevima, a mogu i zbog hemijskih sli~nosti ds reaguju sa drugim }elijama koje nosa Ag za ta At. Kada se u transfuziji daje krv, ne daje se puna krv, ve} koncentrat eritrocita jer tu nema mnogo At.


II D-antigen na eritrocitu , to je Rh+ grupa ( veliko D jer je to dominantna osobina). U krvi osoba koje su Rh- nema anti-D-At, mogu se stvoriti jedino kada osoba primi Rh+ krv.
U trudno}i kod Rh- `ena, a kad je plod Rh+ (zbog oca), stvaraju se anti-D-At, u poslednjem trimestru, kad de~iji eritrociti pro|u u krv majke ili u toku poro|aja, majka se senzibili{e, stvaraju se anti-D-At (M klase, a posle G). M ne mogu da progu placentu jer su veliki (pentameri), dok IgG mogu da pro|u kroz placentu.
U prvoj trudno}i nema opasnosti za plod, memorijski limfociti }e se u narednoj trudno}i aktivirati, prolaze}i kroz placentu i desi}e se poba~aj ili antitela vezuju de~ije eritrocite (koji su u ovom slu~aju Ag), dolazi do lize de~ijih eritrocita i razvija se anemija kod beba (hemolizna bolest novoro|en~eta).
Na poro|aju ili u toku trudno}e pri intervencijama se daje Rhogam ili Beoglobin tj. Anti-D-antitela, koji se vezuju za de~ije eritrocite, ubrzavaju njihovu eliminaciju, da ne bi do{lo do senzibilizacije majke.


Direktan Coombsov test za dokazivanje nekompletnih At na eritrocitima koji su senzibilisani in vivo ( kod hemolizne bolesti novoro|en~eta).

Indirektan Coombsov test za dokazivanje nekompletnih At u serumu (npr. Detekcija anti-Rh antitela IgG klase u serumu Rh negativnih trudnica).

Primena testova:

Direktan:

§Rh+ eritrociti fetusa oblo`eni anti-Rh antitelima majke.
§da vidimo da li su se antitela majke vezali za eritrocite bebe (G klasa) uzima se krv bebe, daje se anti-IgG antitela.

Indirektan:

§serum majke (anti-Rh-At) tra`imo titar anti-Rh-At ili anti-D, uzimamo serum, kao antigeni su Rh+ eritrociti

[Bred]

Komplement

Sistem od 30 proteina u solubilnoj (inaktivnoj) ili membranskoj formi.

Ima ulogu u nespecifi~nom imunitetu, a zna~ajan kao efektorski mehanizam humoralnog imuniteta.

System se aktivira na tri na~ina:

Klasi~ni
Alternativni
Lektinski

Da bi se aktivirao klasi~ni put potrebna je interakcija Ag-At. Pripada humoralnom imunitetu.

Alternativni put je va`an kod nespicifi~nog imuniteta. Ne moramo imati At ve} }e samo prisustvo mikroorgani. Aktivirati alternativni put i formiranje Mac kompleksa.

Ova dva puta se susti~u i za sva tri puta, kasna faza je ista ( kada se aktivira C5 komponenta za nju se ve`e C6,C7,C8 i formira se rupa-kanal u membrani }elije, u nju ulazi voda i }elija se lizira ).

I TEST

Test imunohemolize ( test titracije komplementa ili CH50 test )

Ovim testom odre|ujemo ukupnu aktivnost komplementa jer je u nekim stanjima ta aktvinost pove}ana, a u nekim smanjena.

Princip testa je odrediti uk. Aktivnost komplementa i da li je on sposoban da lizira eritrocite oblo`ene antieritrocitnim antitelima.

U niz epruveta ( ili u plo~i za tiraciju ) se naprave razbla`enja seruma.

Treba nam ne{to {to }e aktivirati taj komplement, a to je At vezano za neki Ag ( ov~iji eritrociti oblo`eni antieritrocitnim At ).

Broj eritrocita je standardizovan i standardizovana je koli~ina At kojim su senzibilisani eritrociti.

Kada u svaku epruvetu dodamo senzibilizovane eritrocite aktivira se komplement i ertitrociti }e biti lizirani.

Ovaj put je klasi~an i broj liziranih }elija zavisi od razbla`enja.

Zavr{na ta~ka tirtacije mo`e biti 100% liza i ona se vidi golim okom. Takva epruvetu ima bistru crvenu te~nost usled osloba|anja hemoglobina.

Ali rezultat ~esto iskazujemo kao 50% liza, takva epruveta se odre|uje spektrofotometrijski na osnovu standarda

Npr 50% liza je u epruvetu razbla`enja 1:8. kako izra`avamo takav rezultat??

U toj epruveti imamo 1 hemoliti~ku jedinicu 50% lize – 1CH50, a po dogovoru ta jedinica se izra~ava po ml, i u toj epruveti (npr 1:Cool imamo 8CH50/ml

CH50 – arbitarna hemoliti~ka jedinica je koli~ina komplementa potrebna da lizira 50% eritrocita pod standardnim uslovima senzibilizacije eritrocita sa anti-Er-antitelima.

CH50 se uzima jer kriva zavisnosti stepena lize od komplementaima oblik slova S pa je CH100 neprecizna, dok je CH50 preciznija

II TEST

Test fiksacije komplementa

Slu`i za detekciju Ag ili At

Princip:

Npr. Ho}emo da odredimo prisustvo i titar anti-DNK-At.

U serum se dodaje Ag za AT koja tra`imo, pa dodajemo komplement zamorca i to standardizovana koli~ina od 2-5 CH50 pa se inkubira na 37C.

Unosimo indikatorski sistem koga ~ine o~ije senzibilizovani eritrociti.

Ako u serumu imamo At®reagova}e sa Ag®nasta}e Ag-At®komplement }e se
aktivirati i istro{iti®kad smo dodali ove eritrocite nema lize i test je pozitivan.

Ako nemamo u serumu At®dodajemo Ag®ni{ta se nije desilo® komplement nije istro{en® C lizira }elije

Broj Er i anti-Er-At je standardizovan.

Test je kvantitativan:

Ore|ujemo titar At, prvo razbla`ujemo serum i redom u svaku epruvetu unosimo Ag,C i ona epruvetu koja nema 100% lize ima}e titar At.
Ako je epr. 1:32 100% liza, prva prethodna u kojoj nije 100% liza je 1:16

III TEST

Test imobilizacije troponema pallidum

Uzme se serum pacijenta, uzmu se `ive troponeme, pome{aju se sa serumom i posle inkubacije od 18 sati, napravi se preparat pod mikroskopom i u tamnom polju ispituje se procenat pokretljivosti troponema odnosno procenat `ivih i to je dokaz da u serumu nema At na troponeme

Ako u serumu ima At, ne}e biti pokretljivih troponema odnosno sve su lizirane.

IV TEST
Metode sa obele`enim Ag ili At

Obele`iva~i: radi-izotopi, enzimi, fluorohromi.

Metoda sa radioizotopom je RIA metoda (radio-imuno test).

Test sa solubilom fazom

Imamo tri reagensa: Ag, Ag* obele`eni i At specifi~no za Ag

Radioaktivni izotop J-125

Sve tri komponente se pome{aju i ostavi se da se uspostavi ravnote`a izme|u njih.

Ako u uzorku nema Ag, uzimamo obele`eni Ag* i At specif. za taj Ag*® At se vezuju za Ag* i imamo odre|enu koli~inu Ag* slobodne, nevezane za At.
Ako u uzorku imamo Ag, dodamo Ag* i At® Ag i Ag* se takmi~e za At®kompeticija® At se vezuje i za Ag i za Ag*® slobodni }e biti i Ag i Ag*.

Od ~ega zavisi koli~ina slobodnog Ag*
Od koli~ine Ag u uzorku.

Ovde merimo radioaktivnost u γ – scintilacionom broja~u, i rezultati su izra`eni u CPM jedinicama (count per minute).Merimo ukupnu radioaktivnost, a posle, nekom od metoda, odvajamo slobodnu od vezane radioaktivnosti.

Pravi se standardna kriva.

Test je izuzetno osetljiv i koristi se za odre|ivanje koncentracije hormona.

V TEST
Imunotestovi sa ~vrstom fazom

^vrsta faza: papirni disk, plo~a, epruvetu, bazen,…

Jedna od komponenti, Ag ili At je vezana za ~vrstu fazu, a ono {to odre|ujemo je slobodno.

Primer: odre|ivanje konc. anti-DNK-antitela

Ovo je nekompetitivni test sa radioizotopom

Za papirni disk vezujemo DNK dodajemo serum, Ako ima At veza}e se za Ag, zatim sledi ispiranje da bi ostalo samo ono {to je vezano za DNK.

Treba nam ne{to {to mo`e da se ve`e za ovaj system i {to na sebi nosi radioaktivni obele`iva~.To mo`e biti anti-humano-At sa J-125.

Ponovo ispiramo i merimo radioaktivnost u scintilacionom broja~u, jedinice u CPM, uporedimo sa standardom i formira se standardna kriva.

VI TEST
RAST (radioalergosorbentni test)

Slu`i za odre|ivanje specifi~nih IgE At. Specifi~na su za neki allergen (pollen na primer)

Za ~vrstu fazu vezujemo pollen odnosno allergen, dodajemo serum. Ako ima At, ona se vezuju. Vr{imo ispiranje pa dodajemo anti-IgE-At sa J-125 koje }e da detektuje samo E klasu.

VII TEST
RIST (radioimunosorbentni test)

Za odre|ivanje ukupnih IgE antitela!!!!!!!

Ovo odre|ivanje ne mo`emo odrediti drugim metodama jer su klase E mnogo manje zastupljene u serumu.

Za ~vrstu fazu vezujemo Fc fragment (koji je isti za sva IgE At), ono {to se vezuje za Fc anti-IgE-At je IgE, dodajemo serum ( sa ili bez At)

Posle ispiranja dodajemo ponovo anti-IgE- At koje nosi radioaktivni izotop® merimo®crtamo krivu

Mi ~vrstu fazu vezujemo za anti-IgE-At jer nam trebaju njegovi Fc fragmenti da bi se vezao IgE pa onda ide serum.

ELIZA

Metoda za detekciju At.

Moramo imati enzim vezan za At pa se dodaje supstrat za taj enzim i kad oni izreaguju dobijamo obojeni complex i merimo intezitet boje spektrofotometrijski.

Enzimi:

Alkalna fosfataza (iz tankog creva teleta) njen supstrat je p-nitrofenilfosfat, a produkt razgradnje ovog supstrata pod dejstvom enzima je p-nitrofenol `ute boje.

Ren-peroksidaza (iz korena rena) njen supstrat je o-metildiamin ili tetra-metilbenzidin.

Princip testa: za merenje koli~ine At u serumu

Merili smo anti-DNK-At (to su auto-At®javljaju se kod nekih autoimunih bolesti)

SLE®sistemski lupus erimatodes (sistemska autoimuna bolest)

Uzorak krvi centrifugiramo i izdvojimo serom®napravimo razbla`enja seruma u puferu®prenosimo u mali bazen koji se nalaze na plo~ama za elizu. Na dnu bazena je pri~vr{}en Ag (DNK u na{em slu~aju).

Ako u serumu ima Ag, on se vezuje za At.

Ispiramo da bi uklonili At koja nisu anti-DNK-At odnosno ona koja se nisu vezala.

Zatim dodajemo At kuni}a na At humana koja su obele`ena enzimom HRP (peroksidaza)

Inkubacija pa ispiranje i onda dodajemo supstrat koji se vezao za enzim i dao neko bojeno jedinjenje.

Intezitet boje izmerimo spektrofotometrijski i poredimo sa standardom.

Elizom se mogu detektovati i Ag: Citokini, HBS-Ag

Ag je IL-2

Odre|ujemo koncentraciju Ag IL-2

Princip:

Za bazen nam je vezano monoklonsko anti-IL-2-At (mi{ijeg porekla), dodajemo uzorak sa IL-2 Ag, inkubacija, ispiranje, pa dodajemo anti-IL-2-At sa enzimom (ovo At je poliklonsko ). Monoklonsko telo }e vezati svoje antigenske determinante i ostaviti ostale za poliklonsko.


Dodajemo supstrat, stvara se obojen complex, merimo intezitet i upore|ujemo sa standardom, a koncentraciju odre|ujemo preko standardne krive.

Zove se sendvi~ test ili jednostepeni sendvi~ test.

Sve je isto osim zavr{nih koraka: poliklonsko At je neobele`eno i npr. kuni}evo je. Treba nam obele`iva~ vezan za At. Dodajemo At na At koje nosi enzim.


Virus HIV-a se ispituje elizom® tra`imo anti-HIV-At i ako je pozitivan test radimo potvrdni test Western Blot.



IMUNOHISTOHEMIJSKE METODE


Samo za detekciju Ag ili At na povr{ini }elija, unutar }elija, u tkivima, na povr{ini mikroorganizama.

Imunofluorescencija (obele`iva~ je fluorohrom) i imunoenzimske (obele`iva~ je enzim) tehnike.

Imunohistohemija u u`em smislu se odnosi na primenu obele`eni At na tkivne preseke a imunocitohemija se odnosi na razmaze }elija, citospin preparate i kulture od jednog sloja }elija.

Imunofluorescencija

At su obele`ena fluorohromima i njima detektujemo Ag.

Kada se ta At ozra~e svetlo{}u odre|ene l fluorohromi adsorbuju tu energiju i konvertuju je u svetlost ve}e l .

Fluorohromi:

Fluorescein izotiocijanat (FITC) emituje zeleno svetlo
Fikoeritrin (PE) emituje naran|`astu svetlost
Peridin hlorofil protein (PERCP) emituje crvenu svetlost

Ovu fluorescence registrujemo fluorescentnim mikroskopom.



Direktna fluorescenca

Imamo presek limfnog ~vora mi{a i ho}emo da detektujemo CD4+ limfocite na tom tkivu.

Uze}emo anti-CD4-At ( NE PI[EMO +) koji nosi fluorohrmo FITC i pod fluor. mikroskopom imamo tamna polja sa zelenim regionima i to je direktna fluorescenca jer je obele`eno primarno antitelo.

Ako odre|ujemo CD4+ }elije mi{a onda su antitela anti-mi{ja-CD4-At !!!!!!!!!

Indirektna fluorescence

Imamo primarna antitela anti-mi{ja-CD4-At koja su neobele`ena i kuni}eva su, dok su sekundarna anti-Ig-at obele`eno FITC-om.

Prednost ove metode je dobijanje intezivnije fluorescence i mo`emo primarno At da bojimo sa vi{e boja.



Imamo npr. presek timusa i tu su sve ~etiri populacije }elija (koje se javljaju tokom sazrevanja) i mi ho}emo da odredimo dvostruko pozitivne }elije i CD4+ i Cd8+

Preparat bojimo sa dve razli~ite boje® dvostruko bojenje

Koristimo dva razli~ita At sa dva razli~ita fluorohroma

Ovim metodama mo`emo da detektujemo intracelularne structure: jedro, citokelet jer At ulaze u }eliju.

Mana ovih metoda je {to takvi preparati traju jako kratko dok kod imunoenzimskih tehnika mogu da traju godinama.

Proto~na citofluorimetrija

Podrazumeva istoimeni preparat koji mo`e da detektuje fluorescencu u suspenziji }elija.On pokazuje procenat }elija koje fluoresciraju i intezitet njihove fluorescence.
Koristi se za odre|ivanje broja }elija u suspenziji, za odre|ivanje varijabilosti }elija (`ive/ mrtve) u dijagnostici leukemija.

Imunoenzimska tehnika

Za detekciju povr{inskih Ag u }el.,na }el.; At koja se koriste su obele`ena enzimom.

Enzimi:

Alkalna fosfataza – supstrat FAST RED crvena boja
Peroksidaza – supstrat vodonik-peroksid + DAB braon boja

Kod elize je cilj dobijanje solubilnog produkta koji bi se razlio po bazenu (svuda podjednaka boja), a ovde nam treba nesolubilan produkt i da Ag ostane na mestu na kom se At vezalo za njega.

Direktna imunoenzimska tehnika (isto kao fluorescenca)

Citospit preparat dendriti~nih }elija- detektujemo mol. Na ovim }elijama ( MHC1, MHC2, CD80, CD86,…)
Ako je At obele`eno (anti-MHC-At) onda je direktna metoda a ako je neobele`eno onda je indirektna metoda.

Za poja~avanje signala se koristi Biotin-Avidin system koji se jako vezuju me|usobno.

Biotin vezan za At a avidin nosi enzim.

Imamo primarno At, dodajemo sekundarno At, dodajemo avidin sa enzimom i supstrat.

[Bred]

Metode ispitivanja }elija imunskog sistema


Postoje tri faze imunog odgovora:

-prepoznavanje Ag odstrane limfocita
-aktivacija (proliferacija i diferencijacija) limfocita
-efektorska funkcija

Razli~itim metodama mo`emo meriti sposobnost proliferacije i sposobnost efektorskih funkcija T i B limfocita.

T limfociti

Test proliferacije

IN VITRO

Radi ispitivanja celularnog imuniteta

Prvi korak je izolacija }elija na gustinskom gradijentu®izoluju se mononukleari, zatim ih stimuli{emo da proliferi{u

Stimulus za T limf. je njegov Ag, me|utim u tim mononuklearima je jako mali broj onih koji }e da odreaguju samo sa tim Ag, zato koristimo poliklonske aktivatore koji aktiviraju veliki broj klonova, bez obzira na njihovu specifi~nost.

Poliklonski akrivatori su mitogeni – proteini iz biljaka LEKTINI, koji se naj~e{}e koriste.

Mitogeni za T limf. su fitohemaglutinini (PHA), konkanavalin A ( CON A) i anti-CD3-mAt koje je monoklonsko.

Zajedni~ki aktivator T i B limfocita je pokeweed mitogen (PWM)

Oni se vezuju za {e}ere glikoproteinskih molekula(CD3, TCR) na povr{ini T limfocita i vezuju se nespecifi~no (bez obzira na vrstu CD3) i tako se aktiviraju T limfociti i proliferi{u.

IN VIVO

Neke bakterije lu~e toksine koji mogu da aktiviraju ve}i broj klonova i ti produkti bakterija se zovu superantigeni.

Posledica takve aktivacije je pojava SEPTI^NOG [OKA kod pacijenta- toxin aktivira ve}i broj T limfocita bez obzira na specifi~nost a oni tako aktivirani lu~e citokine® smanjuje se krvni pritisak i temperatura, a mo`e do}i do smrti.

Superantigeni mogu da premoste TCR i MHC molekule.

Superantigen se sa jende strane vezuje za tip beta lanca, a sa druge strane za MHC na nekoj antigen prezentuju}oj }eliji i tako imitira vezu izme|u T i MHC, i tako se aktiviraju T limfociti.

Odatle svi T limfociti sa tim specifi~nim B lancom mogu biti aktivirani, zato oni ne aktiviraju sve klonove (kao mitogeni).

Mononukleari su izolovani iz periferne krvi® kultivi{emo ih u prisustvu mitogena na elisa plo~i® sve to stoji 3-5 dana u termostatu na 37ºC, i onda merimo proliferaciju limfocita. To radimo tako {to 16-18 sati pre isteka kultivacije dodajemo radioaktivno obele`eni timidin koji se ugra|uje u DNK novosintetisanu od strane proliferisanih }elija.

[to je vi{e timidina ugra|eno ve}a je i proliferacija.

Scintilacioni broja~ meri radioaktivnost, a ona je mera proliferacije. Jedinica je CPM.

Merenje efektorskih sposobnosti T i B limocita

Merenje produkcije citokina sa vr{i elisom ili elisa spot metodom.

Elisa-spot metoda

Obele`iva~ je enzim.

Ako npr. tra`imo IL-10, za dno bazena vezujemo anti-IL-10-antitelo, dodajemo T limfocite da vidimo da li produkuju te citokine.

Ako T limfociti produkuju IL-10, oni se vezuju za At. Zatim odlijemo te }elije iz bazena, dok su u bazenu ostali citokini vezani za At.

Dodajemo sekundarna At sa enzimom, a onda i supstrat koji daje nerastvorni produkt da bi on ostao na mestu gde se At vezalo za enzim i formirao ta~ku.

Bazene analiziramo tako {to brojimo ta{ke mikroskopom i tako dobijamo informaciju o procentu }elija koje produkuju taj citokin, ne o njihovoj koli~ini.

Test za ispitivanje citotoksi~ne aktivnosti T limfocita

Citotoksi~ni limfociti su spremni da ubiju tek po{to ih ne{to aktivira.

Postoje dve faze testa: faza senzitacije i efektorna faza

1. kultivi{emo mononukleare sa nekim stimulatorima (}elije koje nose virusni Ag) i u toku tih 5-7 dana kultivacije postale su efektorske }elije i spremne su da ubiju ciljnu }eliju.
2. koliko su spremne da ubiju vidi se u ovoj fazi. Uzimamo }elije koje su sada efektorske iz kulture i dodajemo im iste ove }elije koje su ih stimulisale, ali su obele`ene radioaktivnim hromom (hrom je u{ao u target }eliju, nije na povr{ini }elije koje stimuli{u) i de{ava se citoliza i osloba|a se hrom koji je sada u supernatantu (te~nom delu) i radioaktivni hrom merimo scintilacionim broja~em

B limfociti

Test proliferacije

IN VITRO


Mitogeni su lipopolisaharid (LPS-mi{iji B limfocit) i protein A stafilokoka-SpA (humani B limfocit).

Izvo|enje testa isto kao i za T limfocite.

Postoje i druge metode za merenje proliferacije (va`i i za T i za B limfocite).

Sve je isto samo koristimo umesto timidina neradioaktivni reagens BRDU.

Ugradi se u monosintetisanu DNk i posle kultivizacije, }elije se permeabilizuju i denaturi{e im se DNK.

To je bitno jer }emo sad uzeti anti-brdu-antitelo obele`eno enzimom (permeabilizacija je bitna da bi antitelo u{lo u }eliju i vezalo se za DNK.

Supstrat dodajemo koji daje obojeni rastvorni produkt i intezitet boje merimo spektrofotometrijski- time dobijamo informaciju o intezitetu proliferacije.

MTT test (va`i i za B i T limfocite)

[to su }elije metabolizma aktivnije njihovi produkti redukuju MTT i nastaje formazan plave boje. Intezitet boje se meri spektrofotometrijski.

Test proliferacije

IN VITRO

B produkciju At mo`emo da merimo odre|ivanjem klase At ili At odre|ene specifi~nosti i to radimo elisa testom, RIST ili RAST.

Elispot mo`e da se primeni i kod B limfocita ali u tom slu~aju je u bazenu vezan Ag ( jer B produkuju At) + }elije koje produkuj At i pri~a je ista


NK }elije

Broj Nk }elija u perifernoj krvi odre|ujemo tako {to izolujemo mononukleare.
Suspenziju mononukleara pome{amo sa anti-CD16-At il anti-CD56-At koja su obele`ena fluorohromom. To sve stoji neko vreme a onda ubacujemo epruvetu u proto~ni citofluorimetar, on daje % }elija koje prevodimo u ta~an broj.

Nk }elije ubijaju zara`ene i tumorske }elije (isto kao i CTL) samo {to NK pripadaju uro|enom a CTL specifi~nom imunitetu i NK }elijama nije potrebno aktivirati da bi bile sposobne da ubiju.
Test citotoksi~ne aktivnosti NK }elija

Isti kao efektorska faza testa za citotoksi~nu sposobnost T limfocita.

NK }elije kultivi{emo sa target }elijama obele`ene hromom® NK lizira te }elije i posle 4-16 sati merimo radioaktivnost oslobo|enog hroma u supernatantu.

Reakcije preosetljivosti

Postoje ~etiri tipa

^etvrti tip je kasna preosetljivost.

U osnovi ove reakcije je aktivacija i proliferacija memorijskih Th limfocita koji su prepoznali peptide proteinskog Ag u sklopu MHC molekula II klase na APC.

Aktivirani T limfociti produkuju citokine koji aktiviraju makrofage (INF-γ) i izazivaju inflamaciju i nakupljanje limfocita.

Ispitivanje celularnog imuniteta (test kasne preosetljivosti u ko`i – ko`na proba)

IN VIVO

U stanjima imunodeficijencije, tumora,....

Radi se o intradermalnom davanju Ag sa kojim je osoba ve} bila u kontaktu.Na tom mestu dolazi do aktivacije memorijskih Th®oni produkuju citokine koji deluju na makrofage , oni produkuju svoje citokine i na to mesto dolaze i drugi leukociti i tu dolazi do zapaljenske reakcije.

Reakcija dosti`e max u roku 24-48h

Na ko`i se vidi crvenilo, otok, otvrdnu}e.

Mikroskopski se de{ava nakupljanje mononukleara oko krvnih sudova. Krvni sudovi su dilatovani (vazodilatacija®pro{irenje) otuda crvenilo, pove}ana je propustljivost pa fibrinogen izlazi napolje iz plazme i nastaje fibrin pa otuda otvrdnu}e tkiva.

To je bitno jer mi posle dva dana merimo pre~nik induracije (otvrdnu}a) i ako je on ve}i od 10 mm taj celularni imunitetja zadovoljavaju}i. U suprotnom ili ne{to nije u redu sa imunitetom ili se osoba nije ranije srela sa tim Ag.

PPD je pro~i{}en proteinski derivat, a poti~e iz mikobakterije tuberkuloze.
Kada se vr{e revakcinacije, prvo se uradi ko`na proba®intradermalno se daje PPD, posle dva dana meri se pre~nik induracije i ako je on manji od 10mm uradi se revakcinacija (obrnuto ne).
Pozitivan test ako je r>10mm®osoba je ili bolovala od te bolesti ili je vakcinisana.
Ako je probanegativna® osoba ili nije bolovala ilj je }elijski imunitet oslabljen.

Testovi pre transplatacije

Transplatacija je presa|ivanje }elija, tkiva ili organa iz jedne individue u drugu.
GRAFT je transplantirani organ, tkivo i }elije.
DONOR davalac grafta, RECIPIJENT primalac.

Autologi graft – transplantiran iz jedne individue u istu.

Singeni graft – transplantacija iz jene individue u drugu pri tom su one genetski identi~ne.

Inbredni sojevi – visoko srodni sojevi `ivotinjadobijeni me|usobnim ukr{tanjem vi{e generacija dok se ne dobije homozigot i svi posle nje su geneti~ki identi~ni (kad se spoje dva homozigota).

Alogeni graft – transplatacija izme|u jedinke iste vrste, a genetski razli~ite

Ksenogeni graft – izme|u jedinki razli~itih vrsta

Do odbacivanja nekog organa naj~e{}e dolazi jer organizam ga prepozna kao strano telo.

Hiperakutno – odbacivanje u roku od nekoliko minuta do nekoliko stati
Akutno – posle jedne ili vi{e nedelja
Hroni~no – posle nekoliko meseci

Za{to dolazi do odbacivanja???

Kod alogenog grafta, geni su ispoljeni kao razli~iti aleli: kod dve osobe su oni razli~ito ispoljeni i to organizam prepoznaje ® odbacivanje

Najpolimorfniji geni su oni koji kodiraju MHC molekule, MHC II su na APC, a MHC I su na svim }elijama sa jedrom (nemaju ih eritrociti)

Geni koji kodiraju MHC I : HLA-A, HLA-B, HLA-C
MHC II : HLA-DP, HLA-DR, HLA-DQ

Genski lokus za Mhc molekule nalazi se na 6. hromozomu i nasle|uje se kodominantno. Jedan alel od svakog roditelja.

Imamo 6 razli~itih MHC I na svakoj svojoj }eliji, dok MHC II ima oko 10-20.

Antigeni koj se razlikuju izme|u jedinki istevrste (a razlikuju se zbog polimorfizma gena koji kodira taj Ag) su ALOGENI.

[ta treba uraditi pre svake transplantacije???

1. prvo odrediti krvnu grupu

Geni koji kodiraju krvne grupe su tako|e polimorfni.

Ako se ne poklope grupe dolazi do hiperakutnog odbacivanja jer Ag koji su na Er, oni su i na vaskularnim endotelnim }elijama.

Prirodna antitela recipijenta prepoznaju ove anti gene u graftu i tu se razvija imuni odgovor® aktiviranje komplementa® nakupljanje leukocita®za~epljenje krvnih sudova®ishemija (slaba prokrvljenost)

2. zatim sledi tipizacija tkiva (HLA tipizacija)

Odnosi se na test kojim odre|ujemo prsustvo HLA odnosno MHC molekula, identifikujemo ih i na }el. potencijalnih donora i na }elijama recipijenta.

Kada se receptor i donor podudare, uzima se graft.

HLA-A, HLA-B i HLA-DR se tipiziraju.Postoji 6 mogu}ih neslaganja.

Kod transplatacije srca i jetr ne radi se tipizacija jer su pacijenti u te{kom stanju, pa nema vremena za ~ekanje, a i ti organi se ne mogu dugo odr`ati van organizma.

Bubrezi se mogu odr`ati van organizma jako dugo.

Imunosupresivna terapija- cilj je da suprimiramo (potisnemo) imuni odgovor kod pacijenta.

Osobe pod ovom terapijom pate od infekcija jer je njihov imuni odgovor jako oslabljen.

Mikrocitotoksi~ni test se koristi za tipizaciju.

Mikro®jako male zapremine reagenasa
Citotoski~i®liziraju se neke }elije

U bazene se stavi antiserum sa At na razli~ite alele svakog od ovih gena.Zatim se dodaju mononukleari, pa komplement.U bazenu gde je do{lo do spajanja Ag i At aktivira se komplement i dolazi do lize }elije.

Liza se mo`e primetiti dodatkom boje tripan-plavo koja boji }elijske strukture.

Me{ana leukocitna formula

IN VITRO model onoga {to bi se moglo desiti
IN VIVO nakon transplantacije. Koristi se kao prognosti~ki test za procenu celularnog odgovora na transplatant.

IN VITRO – uzmemo mononukleare davaoca i primaoca i pome{amo ih u bazenu. Kultivi{emo ih 4-7 dana i ako postoji neslaganje u MHC molekulima, me\usobno }e se prepoznati Ag ove osobe i de{ava se proliferacija i jednih i drugih }elija® gu`va u bazenu®radioaktivni timidin dodamo per isteka kultivacije® merimo proliferaciju scintilacionim broja~em® jedinice u CPM.

Ne znamo koje su }elije vi{e proliferovale, mo`emo jedne da ozra~imo ili tretiramo mitomicinom C da bi spre~ili njihovu proliferaciju i to je jednosmerna® slu`e nam kao stimulatori da bi ove druge proliferovale (sve to pre zra~enja). Ova metoda je zgodna kod transplatacije kostne sr`i. Suprimiramo imuni odgovor recipijentu®uradi se transplatacija®mogu}a je reakcija graft protiv doma}ina.

Kad bi radili jednosmernu u ovom slu~aju onda zra~imo }elije doma}ina i gledamo kako ide ta reakcija® taj celularni odgovor je u osnovi akutnog odbacivanja koje je podstaknuto citotoksi~nim limfocitima.

Imamo pacijenta koji je vr{io neke transplatacije i ho}emo da mu ponovo uradimo transplataciju, ali ne znamo da li je razvio At na }elije novog donora.

Tada uradimo UNAKRSNO SPARIVANJE.

Uzimamo serum recipijenta, a od donora Ag na mononukleare®pome{amo®komplement®tripan-plavo

Unakrsno sparivanje pomo}u }elijski posredovane lize
(Metoda citotoksi~nosti pome{anih limfocita – MLC)

Ho}emo da vidimo da li recipijent ima citotoksi~ne T limfocite (CTL) koji su senzibilizani na AG donora, odnosno koji su spremni da ubiju transplantat.

Uzimamo mononukleare recipijenta i }elije oblo`ene hromom sa donora (}elijske mete), a Ctl koji su neobele`eni i poreklom iz primaoca®kad ih pome{amo, ako postoje senzibilisani CTL, oni ubijaju }elije obele`ene hromom® hrom se osloba|a, ide u supernatant i odatle merimo radioaktivnost.

Imunski kompleksi

Deponuju se u razli~itim organima (bubrezi,zglobovi).

Imunski kompleks ~ine solubilni Ag i specifi~na antitela.Ti Ag mogu biti sopstveni ili strani.

Bolesti koje u svojoj osnovi imaju taj 3. tip preosetljivosti su sistemski lupus erimatodes, poststreptokokni glomerulonefritis.

Bez obzira na poreklo Ag on mo`e da se deponuje bilo gde i na mestu deponovanja javlja se oboljenje.

Deponovanjem se spaja Ag i At®klasi~ni put komplementa® razvoj zapaljenske reakcije.




Metode kojima mo`emo detektovati imunske komplekse su:

-u serumu i u telesnim te~nostima
-u tkivima


Metode u serumu i u telesnim te~nostima

Fizi~ke metode

1. Talo`enje pomo}u polietilenglikola

Imamo slobodna At i imunski kompleks® dodajemo2% PEG koji talo`i imunski kompleks, slobodna At (IgG ili IgM) ostaju u supernatantu

Talog IK rastvorimo i u tom talogu mo`emo da kvantifikujemo IK metodamo RID ili nefelometrijom

C1Q je vezan za ~vrstu fazu (zid epruvete). C1Q je podjedinica komplementa

At u Ik }e se vezati za C1Q (slobodna At ne}e)

Isperemo epruvetu i ostali su nam vezani kompleksi® dodajemo (anti-Ig-At) At obele`eno radioak. Obele`iva~em i ono se vezuje za At koje je u komplexu.

Naj~e{}e se koristi anti-Ig-at (ono je i za IgG i IgM) jer ne znamo koja su nam Ag samo znamo At.

Radiotest te~ne faze

C1Q obele`en radioaktivnim izotopom, dodaje se u uzorak gde se vezujeza Ik (ne vezuje se za slobodna At)® preticipacija Ik sa Pegom® merenje radioaktivnosti taloga

Metode u tkivima

Plo~ica sa presekom bubrega gde tra`imo IK® metode za to su fluoresc. ili imunoenzimske metode.

Reagensi su (At obele`eno enzimom ili fluorohromom) Anti-Ig-At ili anti-C3-At ( C3 je komponenta komplementa, a ona je bitna u klasi~nom putu komplementa odnosno aktivacije istog)

POsle imunoenzimskog bojenjea koristimo svetlosni mikroskop (nikada ne koristimo spektrofotometar kada su tkiva u pitanju).

Imunofluorescenca® fluorescentni mikroskop.

[Bred]

SOUTHERN BLOT – metoda za detekciju specifi~nih DNK fragmenata

NORTHERN BLOT – za detekciju specifi~nih RNK fragmenata

WESTERN BLOT – za detekciju proteina


WESTERN BLOT

Za detekciju i odre|ivanje molekulske mase proteina u nekom uzorku.

Proteini iz sme{e se razdvajaju elektroforetski metodom SDS page na osnovu njihove molarne mase.

SDS® sodium dodeci sulfat
Page® gel (poliakrilamid) u kom se vr{i razdvajanje. ^ine ga akrilamid i metilen-bis-akrilamid.

Dok se gel ne stvrdne izme|u dve plo~e, stavi se plasti~ni ~e{alj koji formira bazen~i}e u koje stavljamo uzorke.

Komponente gela su toksi~ne.

Sme{a proteina® vr{imo denaturaciju, dodamo Sds® ostane im samo primarna struktura i svi dobiju negativno naelektrisanje.

Kad stavimo uzorak u bazen, uklju~imo struju i proteini putuju prema pozitivno naelektrisanoj elektrodi i razli~itim brzinama.

Brzina njihovog kretanja zavisi od njihovie molekulske mase.

Posle nekog vremena prekida se elektri~no polje, proteini se zaustavljaju na razli~itim pozicijama®najdajlje }e sti}i najlak{i.

Sa komazi-blu bojimo proteine da bi ih videli u gelu.

Uporedo sa uzorcima, imamo standarde koje dobijamo od proizvo|a~a®za svaku traku u zavisnosti od mase.

Da bismo identifikovali proteine, moramo uzeti specifi~no At.

Interakcija Ag i At nije mogu}a u ovom gelu, sve treba preneti na nitr celuloznu membranu.

Proteini u tom transferu gube SDS i nisu vi{e denaturisani i tako|e ostaje isti raspored proteina kao {to je bio u gelu.

At specifi~no za neki od proteina mo`e da bude obele`eno enzimski ili radioaktivno (jer mi na memebrani na vidimo fleke proteina zato uzimamo At).
§ Kad Ho}emo da detektujemo anti-HIV-At, ono {to je razdvojeno u gelu su antigeni HIV-a (te Ag HIV ima na svojoj membrani gp160, gp120, gp41, a p24 je u jezgru).

Ti Ag HIV-a su pre~i{}ene partikule koje se dobijaju od proizvo|a~a.

Gotovu memebranu tretiramo serumom pacijenta u kome su anti-HIV-At (At usmerena protiv razli~itih Ag).

Ako u serumu imaAt, ona }e se vezati za svoj Ag.

Dalje ide inkubacija pa ispiranje.

Uzmemo obele`eno At enzimom, dodamo supstrat, posle toga dobijamo obojeni produkt i na toj memebrani imamo obojenu mrlju na mestu gde se vezalo At (boja komazi-blu se u me|uvremenu izgubi).

Da bi pacijent bio pozitivan na HIV mora biti pozitivan na bar dva Ag iz memebrane i jednog Ag iz jezgra.

Za odre|ivanje molarne mase proteina, mi smo dobili ovu Mr, a za njeno ta~no odre|ivanje formiramo standardnu krivu.


Southern i Nothern blot

SOUTHERN BLOT

Tra`imo fragment na DNK koji nam treba.

Iz }elija izdvojimo DNK onda delujemo enzimom restriktivna endonukleaza koja cepa fragmente na ta~no odre|enim mestima koje prepoznaje i dobijamo fragmente razli~ite du`ine.

Dalje te fragmente elektroforetski razdvajamo u gelu agaroze (i to na osnovi njihove Mr)®manji fragmenti idu najbr`e i najdalje.

Posle razdvajanja, prebacujemo ih na nitroceluloznu membranu® isti im je polo`aj kao u gelu.

Onda vr{imo denaturaciju DNK® dobijamo pojedina~ne lance na koje delujemo obele`enom DNK-probom.


DNK-proba je niz od nekolik nukleotida DNK koji je komplementaran sa onim segmentom DNK koji tra`imo.

DNK proba }e se vezati sa segmentom koji tra`imo (vezuju se kao {to se baze sparuju).

Proba je obele`ena enzimski ili radioaktivnim obele`iva~em.

Ovim testom mo`e da se detektuju virusi iz DNK (proba je tada komplementarna DNK tog virusa), za utvr|ivanje o~instva.

NORTHERN BLOT

Sve je isto, samo {to izolujemo RNK, pre svega iRNK, razdvoji se elektroforetski, nema enzima.

I ovde imamo DNK probu i sve je isto, RNK je jednolan~ana tako da se elektroforetski razdvajaju fragmenti.

Za detekciju RNK-virusa i odre|ivanje produkcije citokina


Hibridizacija in situ

Dokazivanje odre|ene DNK sekvence koja je ugra|ena u genom }elije.

Detekcija se radi na presecima tkiva il na razmazima }elija®postavi se na mikroskopsku plo~icu koja se zagreva da bi do{lo do denaturacije DNK® DNK-proba (mora biti obele`ena enzimom ili radioaktivno)

Kod hromozomskih anomalija, mutacija.

Reakcija lan~anog umo`avanja – PCR

Koristi se za IN VITRO umno`avanje sekvence DNK, koju dalje analiziramo drugim metodama.

Za to je potreban enzim termostabilna polimeraza (Taq polimeraza iz bakterije) koja je stabilna na vi{im temperaturama , trebaju nam prajmeri®grani~nici i deoksi-ribonukleotidi, i aparat koji je programiran.

Princip: imamo DNK i sme{u zagrevamo aparatom, denaturisali smo DNK i ho}emo da umno`imo neku sekvencu.

Prajmer postavimo na po~etak sekvence , temperatura se snizi na 70C i Taq polimeraza po~inje da vr{i svoji funkciju®polimerizaciju lanaca prema pravilu komplementarnosti

Prajmer je tako|e komplemetaran po~etku tog lanca na koji se ka~i, polimeraza produ~ava taj lanac i dobijamo 2 odnosno 4 lanca.

Kada je Taq polimeraza sintetisala novi lanac, stari i novi se isprepletu ponovo , pa se oni opet denaturi{u na visokoj temperaturi i sve ispo~etka s tim {to je novi lanac model za sintezu novijeg lanca i tako se proces ponavlja 20-45 puta

Prvi ciklus traje nekoliko minuta, a cela tehnika par sati , i mo`e na kraju biti umno`eno i do milion sekvenci.

Kod dijagnostike nekih infektivnih bolesti ( tuberkuloza, HIV), infektivnih bolesti (hlamidija).

PCR je bitan za dobijanje nekih rekombinantnih proteina – citokina, hormona, faktora rasta, koji imaju primenu u dijagnostici ili u terapiji kao i za dobijanje vakcina.

[katarina]

   Jao, BRED, ko ne polozi posle ovoga, treba da se zabrine.
Alal ti vera!

[Bred]

Ja sam samo to prekopirao sa starog sajta, inace tekst je ceo otkucao phmarko, pa njemu treba da zahvalis

[katarina]

Ja sam samo to prekopirao sa starog sajta, inace tekst je ceo otkucao phmarko, pa njemu treba da zahvalis

Znam, rekao mi je! Njemu sam vec odala pocast.